4. Preparación de medios de cultivo: Contaminación ambiental

Los medios de cultivo son soluciones acuosas de nutrientes y minerales que favorecen el crecimiento microbiano. Además de cubrir las necesidades nutritivas del microorganismo, los medios tienen a veces otros componentes con diferentes objetivos, como: inhibidores, indicadores de pH, etc., en función del uso que se le vaya a dar.

Tipos de Medios de cultivo: 

a) Según su formulación:

- Medios sintéticos o definidos: Las cantidades de compuestos químicos definidos son conocidas, por ejemplo, glucosa, acetato sódico o amonio cloruro.

-Medios complejos: Contienen componentes de composición química poco definida como extractos de carne o de levadura, peptonas de distintos orígenes (hidrolizados de proteínas). etc., por lo que no podemos precisar exactamente qué especies químicas contienen y en qué cantidad.

b) Según su estado físico:

-Medios líquidos (también llamados “caldos”): Suspensiones o soluciones acuosas de los componentes. Se distribuyen en tubos, matraces o botellas y en ellos los microorganismos crecen dispersos en el líquido.

- Medios sólidos (también llamados “agares”): Contienen un agente gelificante que solidifica la solución, creando un sustrato nutritivo en cuya superficie (o interior) se pueden INMOVILIZAR las células microbianas, dando lugar, a una biomasa localizada: cuando las células inmovilizadas están muy cercanas, el crecimiento produce un ‘césped’ (masa uniforme de cultivo superficial) y cuando las células están dispersas su crecimiento produce colonias aisladas.

El agente solidificante más usado en Microbiología es el agar-agar, polisacárido complejo obtenido a partir de algas marinas, que es bastante resistente a hidrólisis microbiana, produce geles transparentes y resistentes a baja concentración (1,5% p/v), se disuelve mediante ebullición y solidifica a temperaturas inferiores a 45oC.

Los medios de cultivo solidificados con agar se distribuyen en:

• Placas Petri de diferentes tamaños.

• Tubos de ensayo en cuyo interior se deja que el medio solidifique en posición inclinada ( “pico de flauta” o bisel), de forma que se obtiene en un pequeño espacio una superficie de inoculación extensa.

- Medios semisólidos: Contienen una baja cantidad de agente solidificante (0,2- 0,3% de agar) de modo que su consistencia es intermedia entre un medio sólido y uno líquido. En su interior las células sólo están parcialmente inmovilizadas, y pueden desplazarse bien si tienen una movilidad flagelar activa. Los tubos se dejan solidificar en posición vertical, y se inoculan en profundidad, haciendo uso de asas rectas, mediante una picadura profunda.

c) Según su aplicación:

- Medios generales: Están diseñados con el fin de soportar el crecimiento de una gran variedad de microorganismos, siempre que no tengan requerimientos especiales para crecer.

- Medios enriquecidos: Contienen elementos nutritivos especiales que favorecen el crecimiento de microorganismos con necesidades particulares (adición de sangre, complejos de factores de crecimiento, etc.)

-Medios diferenciales: Además de los elementos nutritivos, incluyen en su formulación componentes que cambian el aspecto (color, consistencia, opacidad, etc.) del medio de cultivo en función de si el microorganismo realiza una actividad concreta sobre algún componente, lo que permite DIFERENCIAR los microorganismos con dicha característica de los que no la poseen.

   

- Medios selectivos: Se les ha incorporado uno o varios componentes destinados a INHIBIR el crecimiento de ciertos microorganismos cuyo desarrollo no se desea, con el fin de que no compitan o sobrecrezcan a aquellos otros que se desea cultivar. Se emplean para obtener en cultivo microorganismos que son minoritarios en una muestra, pero que serán seleccionados por las condiciones de crecimiento impuestas por el medio selectivo. Parte del carácter selectivo de uno de estos medios puede deberse a las condiciones de incubación (temperatura, atmósfera, etc.), además de los inhibidores incorporados.

Composición de medios de cultivo, diluyentes y reactivos

 a) Medios de cultivo

IMPORTANTE: Es muy habitual el uso de medios que son a la vez diferenciales y selectivos.

 

Agar Nutritivo

Pluripeptona 5 g/L Extracto de carne NaCl

Agar

3

8 15

Agar Triptona Soja (TSA)

Peptona de caseína 15 g/L

Peptona de soja 5

NaCl 5

Agar 15

pH= 7,2. Esterilización: 121oC, 20 min.

Agar Malta

Glucosa

Extracto de malta

Peptona

Agar

pH= 5,4. Esterilización: 112oC, 30 min.

5 g/L 3

20 g/L 20

5

1 15

Importante

• -  No abrir las placas estériles ni destapar el matraz esterilizado fuera del ambiente estéril.

• -  Todo el material que esté en contacto con el medio debe permanecer estéril, por lo que no se deben tocar zonas estériles que vayan a estar en contacto con el medio una vez esterilizado.

• -  Algunos medios requieren comprobar el pH y su ajuste.

• -  Para evitar que el matraz flote cuando se deja en el baño de agua se pueden colocar pesas para matraces.

OBSERVACIÓN DE LA CONTAMINACIÓN AMBIENTAL

Este apartado tiene como fin mostrar al alumnado, la facilidad con que células y esporas microbianas presentes en el ambiente del laboratorio, contaminan los medios estériles si se exponen sin precaución al aire y polvo en suspensión o al contacto con superficies.

PROCEDIMIENTO:

1. Por grupo, utilizar 4 placas estériles de TSA y otras 4 de Agar Malta.

2. Rotular las placas con el nombre del grupo y la abreviatura CONT. AMB.

3. Añadir en dos placas de TSA y dos de Malta “Ventana” y en las restantes “Bancada”.

4. Abrir las placas de “Bancada” en la bancada central, boca arriba, y dejarlas abiertas 15 minutos.

5. Hacer lo mismo con las placas rotuladas como “Ventana”, dejándolas expuestas al aire al lado de la ventana abierta en la bancada perimetral, durante 15 min.

6. Transcurrido ese tiempo, cerrar todas las placas e incubarlas invertidas en la estufa a unos 28ºC hasta las próximas sesiones. Examinarlas periódicamente a lo largo de 9-10 días.

7. Contaminar también algunas placas de Agar Nutritivo de las que se acaban de preparar, poniendo un dedo encima del agar, “antes” y “después” de lavarse las manos. Para ello, dividir la placa en 3 partes iguales, trazando dos líneas y rotular como “antes”, “después jabón” y “después gel hidroalcohólico”). Si sobran placas, se podrán contaminar cogiendo una muestra con un hisopo del lugar donde las alumnas y los alumnos consideren. Anotar la procedencia, para una mayor trazabilidad.

8. Llevar las placas a incubar a la estufa, colocándolas en posición invertida y a unos 28ºC, como se ha hecho con las preparadas anteriormente. Examinarlas también periódicamente.

• -  ¿Crecen colonias del mismo tipo en ambos medios? ¿Cuál es la principal diferencia?

• No, es observable a simple vista que los microorganismos que han sido capaces de formarse en las placas con los diferentes medios, son diferentes debido a que cada tipo de agar cumple con unos requisitos nutritivos diferentes lo cual favorece el crecimiento de diferentes tipos de microorganismos según el tipo de agar.

• Podemos observar que en el Agar Malta crecen un mayor número de hongos mientras que en el TSA se ven un mayor número de bacterias con diferentes colores.

• -  ¿Hay diferencias entre las placas de bancada y de ventana?

• Las diferencias la verdad es que son bastante destacables debido que se puede ver que el la bancada proliferan mucho más los organismos ya sea con Agar Malta o TSA.

  ¿Hay alguna característica común a las colonias crecidas? ¿Predomina algún tipo particular?

  Predominan los hongos, aunque es verdad que el crecimiento ha sido mucho mayor en el Agar Malta, pero también se observan hongos en el TSA, en el TSA predomina la presencia de bacterias de distintos colores.

  ¿Qué se observa en las placas de Agar Nutritivo? ¿Qué son las manchas que se ven? ¿Hay tipos diferentes de manchas (por ejemplo, diferentes colores y formas)?

  Se observan en su mayoría colonias con texturas mucosas y con diferentes colores entre ellos, amarillo, blancos color salmón etc. También se observan en menor cantidad algunos hongos.

¿Hay alguna diferencia en el crecimiento bacteriano entre las huellas de las placas rotuladas «antes» y «después» y entre el lavado de manos con jabón y con gel hidroalcohólico? ¿Qué significa esa diferencia?

• Sí hay muchas diferencias visuales, en cuanto a textura de las colonias, pero sobre todo en cuanto al color que podemos observar muy diversos colores.

• 
  

  
  

  
  Comparar las placas de agar con la de los demás compañeros de clase y responder a las siguientes preguntas:

  
  

• -  ¿Por qué algunas placas tienen mayor crecimiento que otras?

• 
  

• Hay que tener en cuenta que  la muestra de contaminación de cada alumno puesta en cada placa es diferente, aunque el medio de cultivo sea el mismo los microorganismos sembrados difieren entre los diferentes alumnos.

OBSERVACIONES Y/O INCIDENCIAS

Durante el proceso de incubación alguien desenchufó la estufa por lo que se creó dentro de las placas petri se condensó el agua por deshidratación del agar.