SEGUNDA PARTE: PRÁCTICA Nº 5 – TINCIÓN DIFERENCIAL DE ZIEHL-NEELSEN

v  FUNDAMENTO

Las tinciones diferenciales son aquellas que se emplean para diferenciar de manera explícita los microorganismos. Estas empelan colorantes diferenciales compuestos de más de una sustancia tintórea. 

Dentro de este tipo de tinciones encontramos la tinción diferencial de Ziehl-Neelsen, que permite diferenciar las bacterias ácido-alcohol resistentes (BAAR). Principalmente, se fundamenta en tres fases: la tinción en caliente con un colorante básico, la decoloración con una mezcla de ácido-alcohol y la coloración de contraste.

 

v  MATERIALES

-       Cubeta de tinción aluminio.

-       Puente de tinción.

-       Portaobjetos (x4).

-       Asa de siembra (x2).

-       Hilo de siembra (x2).

-       Pipetas Pasteur (x4).

-       Vaso de precipitados.

-       Pinza de madera (x2).

-       Microscopio.

-       Mechero bunsen.

-       Aceite de inmersión.

-       Algodón.

-       Fucsina fenicada de Ziehl.

-       Azul de metileno.

-       Agua destilada.

 

v  PROCEDIMIENTO

1.     Preparar todo el material necesario para realizar la práctica.

2.     Encender el mechero bunsen para generar un área de seguridad. Colocar con una pipeta Pasteur una gota en el portaobjetos.

3.     Esterilizar el asa de siembra a la llama y con cuidado seleccionar una colonia y suspender en el porta, realizar con los dos cultivos.

4.     Mezclar los cultivos bacterianos en el porta y realizar una extensión o frotis.

5.     Dejar secar al aire.

6.     Fijar por calor con el mechero bunsen y dejar enfriar paralelamente.

7.     Cubrir con fucsina fenicada de Ziehl durante 5 minutos a emisión de vapor, es decir con ayuda de una antorcha (hilo de siembra con un algodón en la punta con unas gotas de etanol, cuando esta se apagué se prepara otra inmediatamente).

8.     Lavar con agua destilada.

9.     Decolorar con alcohol clorhídrico durante 30 segundos.

10.  Lavar inmediatamente con agua destilada.

11.  Cubrir la extensión con azul de metileno durante 5 minutos.

12.  Lavar con agua destilada.

13.  Dejar secar al aire.

14.  Observar la extensión al microscopio, con el objetivo de inmersión (100x).

v  OBSERVACIONES

Hay que tener especial cuidado al aplicar la emisión de vapor con la antorcha de que la extensión no se deseque ni hierva. Además, el calor aplicado actúa como mordiente del colorante.

Al manejar la fucsina fenicada de Ziehl hay que ir con cuidado pues esta:

-       Conlleva un peligro para la salud debido que puede irritar las vías respiratorias, provocar somnolencia, irritaciones, etc. Este es nocivo en caso de ingestión y para el medio ambiente.

-       Es un reactivo inflamable.

-       Conlleva, también, un peligro grave para la salud, puede perjudicar a diversos órganos y se considera cancerígeno y puede provocar defectos genéticos si se manipulan durante el embarazo.

-       Entre otros posibles efectos. 

Por lo general, los tiempos se han respetado de forma estricta en cada tinción y lavado, a pesar de ello, en algunas muestras se veían muchas aglomeraciones de bacterias, esto se debe a que al realizar la extensión con los cultivos se ha recogido una colonia de gran tamaño o es posible que se haya dejado actuar de más alguno de los colorantes.

En las extensiones se han podido visualizar colonias de bacterias de color azul constituidas por Micrococcus luteus (BAAR-) y de color rosa constituidas por Mycobacterium phlei (BAAR+), aun que estas últimas se encontraban en menor proporción en la mayoría de nuestras extensiones.

La Micrococcus luteus es una bacteria ácido-alcohol resistente negativa (BAAR-) con forma de coco que se ha teñido de azul gracias a la tinción de azul de metileno, mientras que la Mycobacterium phlei también es una bacteria ácido-alcohol resistente positiva (BAAR+) pero en este caso se teñirá de rosa gracias a la fucsina.

 

v  ANEXO

Fig. 1. Materiales empleados durante la práctica.	Fig. 2. Pictogramas del envase de la fucsina fenicada de Ziehl.
Fig. 3. Tinción de fucsina con emisión de vapor.	Fig. 4. Tinción de azul de metileno.
Fig. 5. Extensión preparada para la visualización al microscopio.	Fig. 6. Visualización de las extensiones con el aceite de inmersión.
Fig. 7. Colonias de BAAR rosas y azules.	Fig. 8. Colonias de Micrococcus luteus.
Fig. 9. Colonias mayoritarias de BAAR- y algunas BAAR+.	Fig. 10. Colonias mayoritarias de BAAR- y algunas BAAR+.
Fig. 11. Colonias mayoritarias de BAAR- y algunas BAAR+.	Fig. 12. Colonia mayoritaria de Mycobacterium phlei.
Fig. 13. Colonias mayoritarias de BAAR- y algunas BAAR+.